时间安排

实训项目

具体内容

第一天

消毒与灭菌

无菌器材的准备

样品的稀释

无菌室的消毒灭菌使用

紫外线消毒、干热和湿热灭菌

无菌器材的准备

无菌操作样品的稀释

第二天

培养基制作

细菌分离培养技术

伊红美蓝基配制

斜面接种🧑🏻‍🦼‍➡️、划线分区接种

第三天

细菌简单染色

细菌革兰氏染色

细菌涂片技术

细菌简单染色、细菌革兰氏染色

镜检技术

第四天

水样标本细菌菌落总数测定

综合训练，完成检测实验

第五天

综合测试

测试无菌操作及染色技术、镜检技术

第六天

细菌菌落总数测定

细菌菌落总数测定结果及分析

项目

考核内容

操作标准

准备

正确准备

准备：穿着实验服，戴上橡胶手套、口罩，正确在血平板和待接种管做编号

无菌

无菌操作

无菌：左手持培养皿🚴🏻，打开皿盖约45-60°角，右手持接种环🏊🏿⬜️，在酒精灯8-10cm范围内进行无菌操作🧣。

接种环

使用

灭菌👮🏿‍♂️、冷却、取菌

灭菌：点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环柄👩🏽‍🚀，将接种环垂直放在内焰上灼烧😜。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红🦸🏼🐚，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分🦛，要彻底灼烧以免灭菌不彻底；

冷却：灼烧后的接种环需冷却，可触及琼脂表面无菌处或平皿盖处冷却（注👼🏽：为评分标准的统一化🌍，冷却操作动作需明显，不可在空气中冷却，防止引歧义⚠，以下提到冷却均统一操作）；

取菌👇🏽🧚🏼‍♂️：冷却后的接种环挑取单个标本菌落，且培养基无划破。

分区

划线

第一区

第一区：将标本均匀涂布于平板边缘，约占平板的1/5，同时确保培养基无被划破🏎，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第二、三🤣、四区

第二区：调整培养皿至适合操作的位置，灼烧后的接种环冷却（注👲🏽：同上），将接种环通过第一区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅，培养基无划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第三区👩🏽‍🦱：调整培养皿至适合操作的位置🐞，灼烧后的接种环冷却（注🔛：同上），将接种环通过第二区3-4次，进行连续不重叠划线🫵，均匀流畅🕵️‍♂️，培养基被划破⬆️，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第四区：调整培养皿至适合操作的位置🏃‍♂️，灼烧后的接种环冷却（注💶：同上）👨‍🦽，将接种环通过第三区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅，不与第一区交叉，培养基无划破🧑🏼‍💻，对接种环进行彻底的灼烧灭菌，放置试管架上📰，培养皿需倒置。

斜面

接种

手持试管及

接种环

将菌种管与待接种管持在左手拇指、食指、中指及无名指之间🙅🏽‍♀️，菌种管在前，接种管在后🤮，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～60度角🍋。右手持接种环进行灼烧灭菌（同上）🚀🧙🏿‍♂️。

接种

用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管塞👇🏿🦹🏽‍♂️，将试管口缓缓过火灭菌🚅。

将灼烧灭菌的接种环伸入菌种管内〽️，先接触无菌落生长的培养基，待冷却后再从斜面上挑取少许菌落📛，在火焰旁迅速伸入接种管，在斜面底部自下而上划一条线，再从底部向上做S形划线。接种完毕，取出接种环，灼烧试管口及管塞👨🏼‍🎓，并在火焰旁将管塞旋上，再重新仔细灼烧接种环后👨‍🎤，放回原处，并塞紧管塞。

培养

倒置培养皿

操作结束，将待接种管和倒置的血平板置于35-37℃培养箱进行18-24h的培养。

文明

操作

实验台面清理

操作过程未造成培养基🙋🏽‍♀️、桌面、身体衣物及环境污染🍋，熄灭酒精灯🕢，清理桌面上的实验废弃物。

项目

考核内容

操作标准

制片

滴加无菌生理盐水

涂片🧒🏿：取一洁净的载玻片，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，按无菌操作要求（注🧖🏼：单手持无菌培养皿，打开皿盖约45°角，另一手持接种环，在酒精灯8-10cm范围内进行操作）🚶，用接种环挑取少量细菌于玻片中央水滴中📃，均匀涂布，形成直径约为1-1.5cm的菌膜，要求涂片薄而均匀🧑🏼‍🎤💂🏻‍♂️。（注：涂片是否均匀将在镜检中进行判定）

干燥：为在规定时间内完成操作🌯，可以利用酒精灯火焰温度干燥涂片💁🏿‍♂️，注意不能太靠近火焰（应在酒精灯火焰上方约半尺处），在固定之前要保证菌种细胞活性🌺💫。

接种环的使用

涂片、干燥

固　定

固定👩‍❤️‍💋‍👨：涂片干燥后，以钟摆速度将玻片（菌膜面朝上）通过酒精灯火焰3次，进行固定。   

革兰氏染色

初　染

初染：用结晶紫染液（使用塑料吸管，下同）覆盖涂菌部位，染色10s，水洗至流出水无色

媒染🧑🏼‍💼🍢：用卢戈碘液覆盖涂菌部位10s🔳，水洗至流出水无色🔶。   

脱色：用95%乙醇脱色（持续10-20s），稍后立即洗去乙醇。   

复染：用沙黄染液染色10s，水洗至流出水无色🐻‍❄️。

媒　染

脱　色

复　染

干  燥

干燥💻：为在规定时间内完成操作⚇，可以利用擦镜纸吸去玻片上残余水珠，进行干燥。

镜检 

显微镜的使用

①载玻片安置🚣🏻‍♂️：移开镜套，插上电源，打开显微镜🤨，将载玻片放置于载物台上并用标本夹夹住；

②调节光源🙍🏼‍♀️：调节光源到适当的照明强度

③低倍镜观察：移动推进器使观察对象处于物镜的最下方🤹🏿，转动粗准焦螺旋，在视野中寻找物像😱，再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰🐚。

④油镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将低倍镜转离工作位置🦸🏻，在待观察的目标区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置🧑‍🦽‍➡️，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中🏄🏼‍♂️。调节照明使视野的亮度合适，微调细准焦螺旋使物象清晰。

染色结果判断

染色结果判定：在实验结果记录表上完成对染色细胞形状（球状或杆状）和颜色（紫色或红色）的描述🥂，并判断细菌属于革兰阳性菌或革兰阴性菌。

显微镜清洁和归位

镜检完毕处理：

①缓慢下降载物台至最低位置🚅，调节光源到最暗，关闭电源开关。

②取下载玻片。

③清洁显微镜：先用擦镜纸擦去油镜镜头上的香柏油👩‍👩‍👧‍👦🦏，再用沾有少许二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯（注👦：需要按同一个方向擦洗镜头）。

④清洁后，将物镜转成八字形🛷，将推进器归位，拔下电源🕦，罩上镜套。

文明

操作

实验后台面整理

操作结束，将载玻片放入消毒液中，用酒精灯盖子熄灭酒精灯（注：酒精灯应在制片结束后立即熄灭），清理桌面上的实验废品。

器皿破损

细菌革兰染色显微镜观察结果记录

形状描述：

细菌细胞颜色：

结果判断：

项目

考核内容

操作规范

称量

天平的准备

调节电子天平水平泡至中间位置。

称量前应先将电子天平调零。

称量操作

称量纸的边角应对折防止培养基撒出➝。

获取不同的培养基成分应使用不同的药匙，不同的称量纸✌🏼，防止交叉污染。

药品称量完成后应盖好瓶盖并放回原位。

天平使用后应关机、清扫天平盘💢。

溶化

培养基溶化

先用量筒量取300ml蒸馏水，加入1/2左右的水到烧杯中，置于电热套上加热😭。先将蒸馏水加热是为了节省时间保证实验能够在规定时间内完成📺👇🏽。此步骤可在称量前进行。

将培养基各种成分按配方称量好后©️🚠，应及时放入烧杯中，防止部分培养基受潮粘在称量纸上。

培养基在溶解过程中需不断搅拌,防止培养基粘到烧杯底部引起培养基烧焦🧑🏻‍🎄，溶解过程要注意调整火力防止培养基溢出，溶解至培养基澄清无沉淀，表明培养基溶解彻底😡。

将量筒内剩余的水加入到以上培养基中，搅拌混合均匀🫢。

调酸

碱度

PH的测定

用玻璃棒蘸取少量培养基，在试纸一端点一下即可，根据酸碱度利用1mol/L NaOH和1mol/L HCl进行调节PH👷🏽。

调节PH时需将培养基转移到烧杯中便于搅拌混匀,调PH值时👋，边滴加试剂边搅拌，并随时用PH试纸测量。

分装和包扎

分装

根据分装量可选择不同的量筒分装🆚🫳，分装过程中应注意操作防止培养基洒出👷。

本实验提供250ml的三角瓶用于分装培养基✝️，一般装液量为100ml左右。

分装时应避免培养基粘附瓶口💅🏼，以免引起污染👩🏽‍⚕️。

包扎

分装完成后包好封口膜后，外面包牛皮纸一层或旧报纸二层，用绳正确捆扎，不打死结。

包扎完成后可在牛皮纸或报纸上面标注培养基名称😘、制备日期及制备人编号☝️，并贴上灭菌指示带便于灭菌结束后判断培养基是否灭菌完全。

灭菌

灭菌锅的

使用

首先将内层灭菌桶取出🚣🏽，再向外层锅内加入适量的水🙎🏿，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂🪚。 加水最好加去离子水或蒸馏水🤳，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。

放入培养基，加盖并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓💂🏻‍♀️，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

盖严锅盖后接入电源，打开排气阀排气🥰，准备灭菌。因时间限制🪇，本实验将这一步作为实验完成标志。

文明

操作

实验后台面整理

台面的整理包括将各药品归位，以及实验台的整理等👲。

器皿破损

器皿破损主要指操作过程出现的玻璃板、烧杯、三角瓶等器皿的损坏情况。

项目

 考核内容

操作标准

菌  落  总  数  的  测  定

编号

用油性标记笔在所需的试管和培养皿皿底上做好标记，以便区分。

稀释

用10ml的无菌吸管吸取9ml无菌生理盐水到无菌试管中👂🏼，用1ml无菌吸管吸取1ml水样💋，沿管壁缓慢注于盛有9ml无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面）🂠，在涡旋振荡器上使其混合均匀，制成1:10的样品匀液📺。

加样🖼、对照

选择原液和1:10这两个稀释度的样品匀液进行检测。吸取1ml样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿🏛，同时，吸取1ml空白稀释液加入到一个无菌培养皿内作空白对照。注意无菌吸管的合理利用，以免重复浪费👷🏼‍♀️。

制备平板

及时将15—20ml冷却至46℃的营养琼脂（事先置于46℃水浴锅）倾注到培养皿🎫，并及时转动培养基使其混合均匀，以免培养基开始凝固后再混匀达不到效果。混匀时注意力度，勿使培养基污染皿盖或溢出。

培养

培养基未凝固时💂🏿‍♂️，培养皿应轻拿轻放，水平静置，待其凝固后方可倒置🦸‍♂️。

倒置培养皿后，将培养皿置于恒温培养箱中，培养温度为36℃±1℃，培养时间为48h±2h。（口述培养温度、时间）

文明

操作

实验台面

整理

等待培养基凝固的同时，利用等待的时间，整理实验台面。将废弃物扔至垃圾桶，已使用的吸管置于回收筒内。用酒精棉球擦拭污染的桌面（培养基若未溢出🤵🏻‍♀️，可免擦拭）。